葉綠體中的光合作用將光能轉化為化學能，吸收二氧化碳，釋放氧氣，是地球生物圈的重要塑造者。葉綠體大約在15億年前通過藍藻內共生進化而來。在進化過程中，葉綠體基因要么被廢棄，要么逐漸轉移到細胞核染色體中，導致大多數陸地植物葉綠體基因組中只保留了110-130個基因，其中大部分基因編碼基因轉錄、蛋白翻譯和光合作用組分。葉綠體基因組中保存著兩種類型的RNA聚合酶，細菌型質體編碼的RNA聚合酶（PEP）和噬菌體型核編碼的RNA聚合酶（NEP）。

葉綠體PEP在原始質體發(fā)育過程中起重要作用，并作為主要的RNA聚合酶在成熟的葉綠體中轉錄80%的葉綠體基因。PEP核心（PEP core）保留了細菌RNA聚合酶類型的結構，包括2個α亞基、1個β亞基、1個β'1亞基和1個β'2亞基，但不含ω亞基，整體分子量約為450 kDa。PEP的獨特特點是若干細胞核編碼真核起源的PEP相關蛋白（PEP associate proteins，PAPs）與PEP core緊密相互作用，并組裝成一個分子量約為1 MDa的超復合物。每個PAP突變表型與PEP core亞基突變體類似，表現(xiàn)出白化/蒼白等葉綠體發(fā)育缺陷表型。盡管大量工作探索了葉綠體PEP的組成和功能，但是真核起源的PAPs如何與和細菌起源的PEP core進行復合物組裝、以及如何調控PEP 的轉錄活性，這些問題尚未得到解答。

2024年3月1日（北京時間），中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心張余團隊和華中農業(yè)大學周菲團隊合作在Cell上以“Cryo-EM structures of the plant plastid-encoded RNA polymerase”為題發(fā)表了封面研究論文。研究團隊基于葉綠體轉化技術，成功建立了煙草葉片中純化內源PEP的方法，解析了葉綠體RNA聚合酶PEP復合物和PEP轉錄延伸復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，揭示了葉綠體基因轉錄機器的亞基組成、亞基組裝方式、特殊功能和功能適應性演化，并為進一步研究葉綠體中轉錄調控的機制和功能提供了結構基礎。

為了純化內源性煙草PEP超大復合物，研究團隊構建了轉基因葉煙草，在葉綠體基因組rpoC2基因的3'端插入了一個編碼串聯(lián)His-Flag標簽的DNA片段。隨后利用30-45的天轉基因煙草葉子，進行親和、離子交換和分子排阻層析等步驟純化，最終得到了高純度的PEP超大復合物，并具有轉錄催化活性。

PEP結構顯示PAP12的結合位置與藍藻RNA聚合酶的ω亞基相同，且一級序列和三維結構高度保守，表明PEP包含一個完整的細菌來源RNA聚合酶，構成了PEP的“催化模塊”。另外15個真核起源的PAPs結合在PEP core外圍，組成了不同的功能模塊，包括“支架模塊”、“保護模塊”、“RNA模塊”和“調控模塊”，是目前已知最復雜的基因轉錄機器。 “支架模塊”由七個亞基（PAP1、PAP3、PAP5、PAP7、PAP8、PAP11和PAP14）組成。與PEP的相互作用界面較大，約占的PEP core表面一半以上，并與PEP core形成了多個亞基間結構域, 不僅穩(wěn)定了“催化模塊”還為其他模塊提供結合支架?！氨Ｗo模塊”由Fe-SOD異源二聚體組成，包含PAP4和PAP9兩個亞基（也被稱為FSD3和FSD2），通過其超氧化物歧化酶功能，保護PEP免受葉綠體中超氧化物攻擊。“RNA模塊”由單個亞基PAP2組成，結合在RNA合成通道外圍，以序列特異性的方式結合RNA，參與并協(xié)助 RNA轉錄后加工?！罢{控模塊”由四個亞基PAP6、PAP13和兩個PAP10（也被稱為FLN1、FLN2和Trx z）組成，參與保護“催化模塊”α亞基的C端結構域，可能參與調控PEP的轉錄活性。這些功能模塊均由細胞核基因組編碼，其在細胞質中被翻譯后轉運到葉綠體與PEP 的催化模塊形成復合物，實現(xiàn)細胞核對葉綠體基因表達的控制。

研究團隊最后對PEP-PAP蛋白亞基進化分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體基因轉錄機器PEP-PAP的演化時間與植物登陸時間基本一致，陸生植物葉綠體基因轉錄機器通過招募這些額外的亞基，演化出獨特的功能和調控機制，幫助其適應陸地環(huán)境和特殊的生命周期。

在基礎研究層面，本研究為進一步探索葉綠體基因轉錄機器的工作模式、理解葉綠體的基因表達調控方式、以及改造葉綠體基因表達調控網絡打下了基礎。在合成生物學應用層面，本研究為植物葉綠體生物反應器的效率提升提供了著手點，助力重組疫苗、重組蛋白藥物、和天然產物的生產。在“碳達峰”和“碳中和”的雙碳目標下，本研究為光合作用系統(tǒng)基因表達水平的提高提供了新思路，助力植物高效碳匯。

中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心副研究員武霄仙和河南大學聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生穆文慧（2020級河南大學“菁英班”學生）為該論文的共同第一作者，張余研究員和華中農業(yè)大學周菲副教授為共同通訊作者。該工作還得到了中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心Chanhong Kim研究員的幫助。本項目受到科技部重點研究計劃、中國科學院先導科技專項（B類）項目和上海市基礎研究特區(qū)計劃的資助。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424000631

葉綠體基因轉錄機器構造

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