E6AP是HECT型泛素連接酶家族的創(chuàng)始成員，最初因與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）的癌蛋白E6相互作用而被發(fā)現(xiàn)。來自高危型HPV的E6會劫持E6AP的泛素連接酶活性，導(dǎo)致腫瘤抑制因子p53的異常泛素化與降解，其結(jié)果與多種HPV陽性癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括超過90%的宮頸癌。HPV E6不僅能改變E6AP的底物，還能以未知的機(jī)制增強(qiáng)E6AP的活性。此外，E6AP活性的缺失/減弱和增強(qiáng)分別與天使綜合征、自閉癥譜系障礙有關(guān)。因此，研究E6AP的活性調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

2024年4月26日，中國科學(xué)院上海藥物研究所余學(xué)奎課題組聯(lián)合羅成課題組在Nature Communications發(fā)表了題為“Structural insights into the functional mechanism of the ubiquitin ligase E6AP”的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術(shù)分別解析了E6AP和E6結(jié)合E6AP不同構(gòu)象復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬分析和生化實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)揭示了E6AP活性動(dòng)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制。

在該項(xiàng)研究中，研究人員首先利用冷凍電鏡技術(shù)，解析了E6AP/E6二元復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了復(fù)合物新穎的“dimer of dimer (protomer)”組裝模式，每個(gè)protomer由一個(gè)E6AP和一個(gè)E6分子組成。其中，癌蛋白E6結(jié)合于E6AP表面由α1-helix和loop-helix-loop元件共同構(gòu)成的、呈口袋構(gòu)象的區(qū)域。在E6AP/E6復(fù)合物中，protomer間的二聚化主要通過E6AP 的α1-helix羧基端的疏水作用介導(dǎo)完成。此外，該研究還成功捕獲了E6AP/E6五種不同狀態(tài)的空間構(gòu)象，并發(fā)現(xiàn)不同構(gòu)象間protomer主要圍繞α1-helix進(jìn)行擺動(dòng)，使得E6AP的催化結(jié)構(gòu)域靠近或遠(yuǎn)離底物，為泛素轉(zhuǎn)移提供結(jié)構(gòu)空間，從而提示以上復(fù)合物結(jié)構(gòu)代表了泛素轉(zhuǎn)移的構(gòu)象連續(xù)體。功能實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步揭示了E6AP/E6 protomer的動(dòng)態(tài)性和二聚化是E6AP實(shí)現(xiàn)底物泛素化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且α1-helix在E6AP二聚化過程中扮演關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上，該研究還解析了E6AP全長單體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，與復(fù)合物中E6AP的結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，結(jié)合E6后的E6AP具有更長的α1-helix，分子動(dòng)力學(xué)模擬分析也證實(shí)E6對E6AP α1-helix延伸區(qū)域具有穩(wěn)定作用。

基于此，該研究首次提出E6對E6AP酶活性的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制：E6的結(jié)合能夠誘導(dǎo)E6AP α1-helix的延長，進(jìn)而促進(jìn)E6AP的二聚化；在復(fù)合物中，兩個(gè)E6AP/E6 protomer通過相互靠近或偏轉(zhuǎn)，使得 E6AP的催化結(jié)構(gòu)能夠更高效地接近泛素偶聯(lián)酶（Ubiquitin-conjugating enzymes，E2）以接受泛素，或接近底物p53以供給泛素。此外，該研究發(fā)現(xiàn)一些與天使綜合征和自閉癥譜系障礙相關(guān)的E6AP突變位于該延伸的α1-helix，提示出這些突變可能影響α1-helix的穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致E6AP功能障礙。該研究的結(jié)果為了解E6AP的生理和病理機(jī)制提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信息，并有助于開發(fā)針對E6AP功能障礙相關(guān)疾病的治療干預(yù)措施。

上海藥物所副研究員王振、博士研究生范鳳英、國科大杭州高等研究副研究員李智海與浙江理工大學(xué)葉飛教授為本論文的共同第一作者，上海藥物所余學(xué)奎研究員和羅成研究員為本論文的通訊作者。該項(xiàng)工作獲得了上海藥物所冷凍電鏡研究中心的大力支持。該項(xiàng)目獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、杭州高等研究院研究基金與臨港實(shí)驗(yàn)室等項(xiàng)目資助。

全文連接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-47586-w

a，E6AP/E6復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)（以Att1狀態(tài)為代表，俯視圖）。b，E6AP/E6復(fù)合物五種構(gòu)象的比對示意圖。兩個(gè)E6AP/E6 protomer之間發(fā)生相互靠近或偏轉(zhuǎn)的構(gòu)象變化。c，E6AP/E6復(fù)合物的E6AP原子模型與單體E6AP的電子密度圖比對。單體E6AP缺失α1-helix延長部分的電子密度，表明E6的結(jié)合誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定了α1-helix的延長。d，HPV E6劫持E6AP酶活性的模式圖。

（供稿部門：余學(xué)奎課題組）