???2024年4月25日，《Cell》期刊在線發(fā)表題為《Generation of rat forebrain tissues in mice》的研究論文。該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）楊輝組、周海波組、美國(guó)得克薩斯州西南醫(yī)學(xué)中心吳軍組、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所郭帆組合作完成。該研究提出了一個(gè)高效的異種囊胚互補(bǔ)系統(tǒng)并首次在小鼠體內(nèi)生成了功能性的大鼠前腦組織，同時(shí)揭示了異種前腦補(bǔ)償嵌合體背景下細(xì)胞發(fā)育的自主性和非自主性性影響。這對(duì)于在進(jìn)化背景下理解腦進(jìn)化的機(jī)制具有重要意義。

????利用干細(xì)胞生成功能性的器官或組織一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。異種囊胚互補(bǔ)技術(shù)使得在一物種內(nèi)培育出另一種物種的器官或組織成為可能。該技術(shù)通過(guò)將多能干細(xì)胞注入到缺失關(guān)鍵發(fā)育基因的宿主囊胚中，由供體細(xì)胞補(bǔ)償宿主缺失的器官或組織，從而培育出源自另一物種的器官。先前研究已成功在小鼠中培育出大鼠的胰腺、胸腺、血管內(nèi)皮組織和生殖細(xì)胞，同時(shí)在大鼠中也培育出小鼠的胰腺、腎臟和生殖細(xì)胞。盡管如此，目前尚未能在異種囊胚中培育出大腦組織。在一物種中培育另一種物種的大腦組織將有助于科研人員從進(jìn)化的角度研究大腦的發(fā)育與功能。

????傳統(tǒng)的囊胚互補(bǔ)方法經(jīng)常涉及構(gòu)建影響特定器官發(fā)育的雜合基因突變小鼠，繁育這些小鼠以產(chǎn)生具有基因突變的囊胚，并將供體細(xì)胞注入這些突變囊胚中以形成囊胚互補(bǔ)嵌合體。這個(gè)過(guò)程不僅耗時(shí)耗力，且不適用于雜合致死的基因。利用傳統(tǒng)囊胚互補(bǔ)方法來(lái)驗(yàn)證特定基因是否能支持某個(gè)器官的囊胚互補(bǔ)是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。為解決這些限制，研究者引入了C-CRISPR（Cocktail of targeting sgRNAs in the CRISPR/Cas9 system）技術(shù)，這種技術(shù)通過(guò)使用多個(gè)gRNA結(jié)合Cas9來(lái)實(shí)現(xiàn)幾乎100%的基因敲除效率，從而避免了基因編輯動(dòng)物的需要。研究者結(jié)合C-CRISPR和囊胚互補(bǔ)技術(shù)，創(chuàng)建了一個(gè)新的系統(tǒng)，稱為CCBC（C-CRISPR based Blastocyst Complementation），該系統(tǒng)允許快速驗(yàn)證目標(biāo)基因是否適合囊胚互補(bǔ)，并能一步生成器官重構(gòu)嵌合體。

???研究者用CCBC系統(tǒng)篩選到了能夠支持前腦互補(bǔ)的基因Hesx1。通過(guò)C-CRISPR敲除小鼠受精卵里的Hesx1基因以阻止宿主細(xì)胞向前腦發(fā)育，讓受精卵發(fā)育到囊胚階段，然后分別向基因突變的小鼠囊胚腔里注射小鼠胚胎干細(xì)胞（Mouse embryonic stem cells,mESCs）或大鼠胚胎干細(xì)胞（Rat embryonic?stem cells,?rESCs）以補(bǔ)償宿主缺失的前腦組織。通過(guò)以上方法，研究者成功獲得了小鼠-小鼠前腦互補(bǔ)嵌合體（Hesx1^-/-??+mESCs）以及大鼠-小鼠前腦互補(bǔ)嵌合體（Hesx1^-/-??+rESCs）。

????所有Hesx1^-/-?+rESCs和Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體都存活至成年，并呈現(xiàn)與傳統(tǒng)嵌合體（WT+mESCs）相似的體重生長(zhǎng)曲線。在這些嵌合體的大腦皮層V層和海馬中，均檢測(cè)到表達(dá)CTIP2的細(xì)胞。在大腦皮層和海馬中，無(wú)論是Hesx1^-/-??+rESCs、WT+mESCs還是Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體，其層厚度和細(xì)胞密度均相似。

????為了評(píng)估Hesx1^-/-?+rESCs嵌合體中大鼠神經(jīng)元的功能，研究者向嵌合體前腦的前外側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層注入了AAV8-hSyn-EGFP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由rESC衍生的神經(jīng)元能夠從這一區(qū)域向丘腦、上丘和腦干中腦區(qū)域投射軸突。電生理測(cè)試表明，這些嵌合前腦中的大鼠和小鼠皮層神經(jīng)元可以隨著電流的增加發(fā)放不同頻率的動(dòng)作電位。研究還確認(rèn)，在Hesx1-/-?+rESCs嵌合體中，大鼠和小鼠細(xì)胞、小鼠與小鼠細(xì)胞、大鼠與大鼠細(xì)胞之間均能形成突觸連接。此外，研究通過(guò)行為學(xué)測(cè)試，包括Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、開(kāi)放場(chǎng)測(cè)試和情境恐懼記憶測(cè)試，評(píng)估了同種和異種前腦補(bǔ)償嵌合體的前腦功能。測(cè)試結(jié)果顯示，WT+mESCs、Hesx1^-/-??+rESCs和Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體在這些行為測(cè)試中的表現(xiàn)無(wú)顯著差異，顯示重建的前腦功能表現(xiàn)正常。這些結(jié)果表明Hesx1^-/-?小鼠胚胎為供體rESCs提供了適宜的發(fā)育環(huán)境，幫助其形成功能性的大鼠前腦組織。

????皮層和海馬的單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果顯示大鼠細(xì)胞在Hesx1^-/-??+rESCs嵌合體中形成了多種類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞，其種類(lèi)和占比接近于WT大鼠的前腦組織。不同神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型下大鼠細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組更接近于WT大鼠細(xì)胞。有趣的是早期胚胎的切片結(jié)果顯示大鼠細(xì)胞形成的前腦組織的尺寸和發(fā)育進(jìn)度與宿主小鼠一致。這表明非細(xì)胞自主機(jī)制決定了器官的大小和發(fā)育速度，而細(xì)胞自主機(jī)制塑造了嵌合體中大鼠前腦組織的整體轉(zhuǎn)錄組特征。

????通過(guò)比較大鼠細(xì)胞在嵌合體與WT大鼠中的轉(zhuǎn)錄組差異，研究者發(fā)現(xiàn)了一些與軸突生成、前腦發(fā)育和神經(jīng)生成調(diào)控等相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過(guò)細(xì)胞相互作用分析，該研究觀察到了多種潛在的配體-受體相互作用，這可能解釋了宿主Hesx1^-/-?小鼠細(xì)胞如何影響供體大鼠細(xì)胞，以及幫助它們?cè)谇澳X中的存活和分化。

????腦智卓越中心楊輝/周海波研究員、美國(guó)得克薩斯州西南醫(yī)學(xué)中心終身教授吳軍和中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所郭帆研究員為該論文通訊作者。得克薩斯州西南醫(yī)學(xué)中心博士后黃佳、賀冰冰、李磊杰，農(nóng)科院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所博士生楊霞麗，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所博士生龍?chǎng)我约澳X智卓越中心博士后魏迎輝為該論文的共同第一作者。

圖1.通過(guò)CCBC在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織。A: 基于CCBC的異種前腦互補(bǔ)嵌合體；B: 表達(dá)tdTomato的大鼠細(xì)胞對(duì)前腦組織的嵌合占比。