北京時間5月20日，國際學術期刊Cell Stem Cell在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）惠利健研究組聯(lián)合仁濟醫(yī)院夏強院士團隊、華東師范大學李大力研究員團隊和上?？萍即髮WiHuman研究所鐘桂生研究員團隊的最新合作研究成果：“Efficient expansion and CRISPR-Cas9-mediated gene correction of patient-derived hepatocytes for treatment of inherited liver diseases”。該項研究在前期工作的基礎上建立了高效的肝臟遺傳代謝性病人來源的肝細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，并且實現(xiàn)了多種病人來源肝細胞的體外長期大量擴增。在此基礎上，研究人員優(yōu)化和建立了CRISPR-Cas9介導的基因敲入技術，實現(xiàn)了在遺傳代謝性疾病病人來源的增殖肝細胞中高效定點糾正病人缺陷基因。此外，基因編輯的增殖肝細胞移植可以高效整合、再殖小鼠肝臟，并成功治療了酪氨酸血癥小鼠模型，證明體外基因糾正的增殖肝細胞治療的有效性。綜上，該研究建立了一套高效的肝臟遺傳代謝性疾病病人來源肝細胞的體外培養(yǎng)和基因編輯技術，為人類肝臟遺傳代謝性疾病的自體肝細胞治療提供了概念上的驗證。

肝臟作為人體新陳代謝的中心器官，其中肝細胞是肝臟功能最主要的承擔者。肝細胞中一些關鍵功能基因的突變會導致危及生命的肝臟遺傳代謝性疾病的發(fā)生，這類疾病的致病基因較多并且病情嚴重，目前除肝移植外尚無有效的治療方式。然而，肝細胞在移植后具有很強的肝臟再殖能力，一些患有肝臟遺傳性疾病的動物模型通過肝細胞移植后得到了有效的治愈。因此，肝細胞移植（Hepatocyte Transplantation,HTx）作為一種替代肝器官移植治療肝臟遺傳代謝性疾病的治療方式具有廣闊的應用前景。但是前期大量基礎和臨床研究結果表明，異體肝細胞治療的長期有效性受限于移植后細胞的免疫排斥。所以，有效避免移植后細胞的免疫清除是實現(xiàn)病人肝細胞治療成功的核心難題。

惠利健團隊長期致力于研究開發(fā)新型肝細胞來源和終末期肝臟疾病治療的相關研究。2018年，該團隊建立了人原代肝細胞（Primary Human Hepatocyte,PHH）大規(guī)模擴增體系，在體外將PHH去分化為可增殖的人肝細胞(Proliferating Human Hepatocytes,ProliHHs)，該細胞介于肝細胞和前體細胞的雙表型狀態(tài)，能夠在體外培養(yǎng)擴增超過10000倍，滿足臨床肝細胞移植所需細胞量。將該細胞移植到肝臟酪氨酸血癥模型Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-（FRG）小鼠時，擴增的ProliHHs重建肝實質的效果能達到非常高的水平，這使其成為極有前景的細胞來源用于肝細胞治療。2024年3月，該團隊實現(xiàn)了大規(guī)模制備海藻酸鈉微膠囊包裹的ProliHHs類器官，并用于肝衰竭治療，為正在進行的臨床研究奠定了堅實的基礎。

為了探究肝臟遺傳性疾病患者來源肝細胞的體外擴增及基因修復后的回輸治療，研究人員首先著手于分離和培養(yǎng)這些肝臟遺傳性疾病患者來源的PHH。經(jīng)研究，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基EHM（Enhanced Hepatocyte Medium），能夠促使來自10種不同疾病基因突變所導致的遺傳代謝性疾病患者來源的肝細胞在體外迅速增殖，并且同一疾病的多個患者表現(xiàn)出相似的培養(yǎng)結果。經(jīng)過連續(xù)的細胞傳代擴增，從1克肝組織中分離的肝細胞（5x10⁶）理論上可以擴增至1000倍，最終可達到5x10⁹數(shù)量級的擴增肝細胞，為后續(xù)治療提供了充足的細胞來源。

隨后，研究人員采用在ProliHHs基因組中定點基因敲入的治療策略來糾正患者的基因缺陷。為了更貼近當前基因編輯細胞的臨床應用標準，他們采用電轉的方法將Cas9-sgRNA蛋白復合體（RNPs）和外源基因片段（Donor）遞送至ProliHHs，以進行基因定點敲入表達。通過優(yōu)化ProliHHs細胞的電轉程序、Donor的定向整合策略和AAV亞型篩選，研究人員實現(xiàn)了顯著高水平的敲入效率（24%-66%）。同時，經(jīng)過基因編輯的細胞傳代培養(yǎng)后，細胞保持相對穩(wěn)定編輯效率。此外，研究人員還嘗試富集基因編輯后的ProliHHs，并對其功能蛋白的表達進行了驗證。最后，為驗證編輯后患者細胞的治療效果，研究人員培養(yǎng)了酪氨酸血癥患者來源的肝細胞，并通過基因敲入方式糾正了患者缺陷的FAH基因。移植后，基因編輯后的ProliHHs成功地整合到FRG小鼠肝臟中，實現(xiàn)了小鼠模型的治療效果。

分子細胞卓越中心張坤博士、仁濟醫(yī)院萬平主治醫(yī)生和華東師范大學王立人副研究員為該論文的共同第一作者。分子細胞卓越中心惠利健研究員、仁濟醫(yī)院夏強院士、華東師范大學李大力研究員、上?？萍即髮WiHuman研究所鐘桂生研究員和分子細胞卓越中心張坤博士為該論文的共同通訊作者。該項工作得到國家自然科學基金委員會、上海市科委、科技部、中國科學院等項目的資助，以及分子細胞卓越中心分子生物學技術平臺、細胞分析技術平臺、化學生物學技術平臺、動物實驗技術平臺的幫助與支持。

文章鏈接：?https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.04.022

基因編輯糾正病人來源可增殖人肝細胞實現(xiàn)遺傳代謝性肝臟疾病治療