?????2024年 6 月 5日，《The Journal of Neuroscience》期刊以封面文章在線發(fā)表了題為《Tbx2在不同年齡轉分化耳蝸外毛細胞命運》的研究論文,該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學研究所)、神經(jīng)科學國家重點實驗室劉志勇研究組完成。該研究探究了轉錄因子Tbx2（內(nèi)毛細胞發(fā)育的關鍵因子）過表達能否轉分化不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸外毛細胞及其前體細胞，以及其轉分化的程度。同時研究人員還探討了Tbx2與外毛細胞發(fā)育成熟相關的關鍵轉錄因子Ikzf2之間的相互拮抗的作用機制，為深入理解耳蝸內(nèi)、外毛細胞命運決定的作用機制提供了新的理論基礎。

Tbx2是耳蝸內(nèi)毛細胞命運決定、分化和命運維持的關鍵因子，Tbx2功能缺失導致內(nèi)毛細胞轉分化為外毛細胞。目前，聽覺領域內(nèi)仍有幾個關鍵的問題亟待澄清：1）過表達Tbx2能否轉分化外毛細胞到內(nèi)毛細胞？2）Tbx2轉分化外毛細胞是否具有年齡依賴性？3）外毛細胞中過表達Tbx2是否可以完全轉分化為內(nèi)毛細胞？4）Tbx2轉分化外毛細胞為內(nèi)毛細胞的分子機制是什么？

為了回答以上4個問題，研究人員構建了Tbx2條件性過表達小鼠模型（簡稱Tbx2OE），然后分別在新生小鼠和成年小鼠耳蝸外毛細胞中過表達Tbx2，發(fā)現(xiàn)均可以把外毛細胞轉分化為內(nèi)毛細胞樣的細胞，并表達內(nèi)毛細胞的標記物vGlut3、Slc7a14和Otoferlin，同時伴隨外毛細胞標記物Prestin的漸進性消失，說明外毛細胞對Tbx2的響應不受年齡的影響。在胚胎期外毛細胞前體細胞中過表達Tbx2則直接產(chǎn)生內(nèi)毛細胞標記物Fgf8+和vGlut3+的內(nèi)毛細胞樣細胞，無Bcl11b和Prestin表達（圖1）。同時，掃描電子顯微鏡結果顯示，外毛細胞前體細胞過表達Tbx2產(chǎn)生的類內(nèi)毛細胞的靜纖毛束與內(nèi)源性內(nèi)毛細胞相似（圖1），說明細胞發(fā)育狀態(tài)越早、細胞可塑性越高，對Tbx2的響應作用越強。

圖1. 過表達Tbx2導致外毛細胞前體細胞分化發(fā)育為與內(nèi)源性內(nèi)毛細胞相似的類內(nèi)毛細胞。外毛細胞前體細胞過表達Tbx2，產(chǎn)生Fgf8+/ vGlut3+/Bcl11b-/Prestin-的類內(nèi)毛細胞（D-D’’’和F-F’’’）,而對照組中則為Bcl11b+/Prestin+/Fgf8-/ vGlut3-的外毛細胞（C-C’’’和E-E’’’）；掃描電子顯微鏡檢測結果顯示對照組（G）中外毛細胞靜纖毛束為“V”字形，而實驗組（H）中在相應區(qū)域產(chǎn)生的類內(nèi)毛細胞靜纖毛束和內(nèi)源性內(nèi)毛細胞一致，呈“一”字形。黃色箭頭表示轉分化的類內(nèi)毛細胞，藍色三角形指示內(nèi)源性內(nèi)毛細胞。

為了進一步探索Tbx2轉分化外毛細胞為內(nèi)毛細胞的分子機理，研究人員通過單細胞Smart-seq對類內(nèi)毛細胞、內(nèi)源性外毛細胞和內(nèi)源性內(nèi)毛細胞進行比較分析，發(fā)現(xiàn)在類內(nèi)毛細胞中有85.6%的內(nèi)毛細胞特異表達基因出現(xiàn)上調(diào)，同時38.6%的外毛細胞特異表達基因出現(xiàn)下調(diào)，提示Tbx2不能使外毛細胞完全轉分化為內(nèi)毛細胞。研究人員發(fā)現(xiàn)外毛細胞發(fā)育成熟關鍵因子編碼基因Ikzf2受到Tbx2的負調(diào)控，推測Ikzf2可能與Tbx2存在于相同的細胞命運調(diào)控通路，并位于Tbx2的下游，且行使與Tbx2相反的生物學功能。為了進一步證實該推測，研究人員構建了在外毛細胞中同時過表達Ikzf2和Tbx2的小鼠模型（簡稱Slc26a5-Tbx2-Ikzf2），確定了Ikzf2對Tbx2的生物學功能具有明顯的拮抗作用（圖2）。該研究揭示了Tbx2-Ikzf2模塊對耳蝸毛細胞命運抉擇的調(diào)控機制，為將來深入解析該網(wǎng)絡調(diào)控通路奠定了扎實的研究基礎。

圖2. 在外毛細胞中Ikzf2對Tbx2發(fā)揮了相反的生物學功能。（A-C’’’）分別為陰性對照組（A-A’’’）、Tbx2OE（B-B’’’）和OHCs-Tbx2OE-Ikzf2OE（C-C’’’）耳蝸毛細胞vGlut3、Prestin和tdTomato免疫組織化學分析；在OHCs-Tbx2OE中tdTomato+細胞的vGlut3表達水平與內(nèi)源性內(nèi)毛細胞相當（甚至略高于內(nèi)源性內(nèi)毛細胞），而Prestin則完全消失；相反，OHCs-Tbx2OE-Ikzf2OE中EGFP+的大部分外毛細胞中vGlut3信號受到嚴重的抑制，同時Prestin信號則仍有微弱的表達，說明Ikzf2對Tbx2的生物學功能具有拮抗作用；藍色和黃色箭頭分別指示內(nèi)源性外毛細胞、Prestin+（弱）/vGlut3- （#1）和vGlut3+（弱）/Prestin-（#2）的細胞。（D）Ikzf2拮抗外毛細胞中Tbx2生物學功能的示意圖。

?????中國科學院腦智卓越中心劉志勇研究員和副研究員李響為該論文的共同通訊作者，副研究員畢政鴻為第一作者，腦智卓越中心博士研究生任旻蕙、高級實驗師賀順姬及上海交通大學第九人民醫(yī)院張宇博士做了重要貢獻。同時上海交通大學第九人民醫(yī)院宋雷教授對本課題電生理內(nèi)容給予了重要的指導。中國科學院腦智卓越中心光學平臺、電鏡平臺、分子細胞技術平臺和嚙齒類實驗動物平臺提供了重要技術支持。該研究獲得了國家自然科學基金委員會、科技部、上海市科委和中國科學院的資助。