4月19日，國際學(xué)術(shù)期刊ACS Sustainable Chemistry & Engineering在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心王勇研究組完成的題為“Design and optimization for efficient production of (S)-canadine in?Escherichia coli”的研究論文。該研究首次實現(xiàn)了(S)-四氫小檗堿在大腸桿菌中的高效合成，為手性藥物的微生物合成提供了參考。

(S)-四氫小檗堿是一種具備降糖、降脂和抗氧化等多種活性的原小檗堿類化合物，也是合成小檗堿（抗菌藥）和諾斯卡品（抗腫瘤藥）的關(guān)鍵前體，在藥物研發(fā)方面具有巨大的潛力。現(xiàn)階段，(S)-四氫小檗堿可通過植物提取或化學(xué)半合成的方式獲得。然而，毛茛目植物根莖中(S)-四氫小檗堿的含量低以及化學(xué)合成的立體選擇性差等因素，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)。微生物制造在手性化合物的合成方面獨具優(yōu)勢，是合成此類高價值產(chǎn)品的重要技術(shù)手段。目前，微生物體系中已能高效合成芐基異喹啉生物堿的共同前體(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿，但是受限于部分膜蛋白的非功能性表達，還未能實現(xiàn)(S)-四氫小檗堿的高效率從頭合成。

本研究首先利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了一個高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌底盤SQZB18，搖瓶培養(yǎng)2天后可積累2.11 g/L的酪氨酸（圖1）。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)四氫生物喋呤循環(huán)途徑整合至基因組前后，過表達大鼠和果蠅來源酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase,TYH）的菌株中(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿的合成趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)。結(jié)合酪胺的結(jié)構(gòu)特征及體內(nèi)飼喂實驗的結(jié)果，推測并證實了酪胺對RnTYHWR的抑制作用（圖2）。研究者后續(xù)巧妙地利用EcHpaBC-D11將酪胺轉(zhuǎn)化為多巴胺，解除了酪胺的抑制作用，并通過過表達嘌呤核酸磷酸化酶，獲得了菌株SQZ227，經(jīng)兩天的搖瓶培養(yǎng)能產(chǎn)生100.13 mg/L的(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿（圖3）。為了克服小檗堿橋酶（Berberine bridge enzyme,BBE）和四氫小檗堿合成酶（Canadine synthase,CAS）功能性表達的難題，研究者將篩選到的薊罌粟（Argemone mexicana L.）來源的小檗堿橋酶（AmBBE1）進行同源建模和分子對接，得到98%轉(zhuǎn)化率的突變體AmBBE1F398W-I431F；另外，在優(yōu)化CAS可溶性表達的基礎(chǔ)上，借助蛋白-肽相互作用結(jié)構(gòu)域（SH3）和其配體（SH3-lig），最終從不同CAS來源的組合中篩選到支架結(jié)構(gòu)的trCjCAS-AtCPR2，體外條件下能將32%的底物轉(zhuǎn)化為小檗堿（圖4）。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合改善膜蛋白表達效率的效應(yīng)因子（RraA）和細胞色素b5，研究者得到了表現(xiàn)最佳的(S)-四氫小檗堿產(chǎn)生菌SQZ266，該菌株在搖瓶培養(yǎng)下的產(chǎn)量達到16.81 mg/L，在反應(yīng)器發(fā)酵條件下產(chǎn)量達到165.74 mg/L（圖5），是目前報道微生物從頭合成原小檗堿的最高水平。該研究不僅提供了生物堿高效微生物底盤的設(shè)計思路，也為生物堿的綠色和可持續(xù)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心王勇研究組博士研究生張前為論文的第一作者，王勇研究組的博士研究生吳宇函參與了相關(guān)工作。該研究得到國家重點研發(fā)計劃、上海市學(xué)術(shù)帶頭人計劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院先導(dǎo)項目及植物分子遺傳國家重點實驗室的資助。

論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.3c08493

在大腸桿菌中實現(xiàn)了(S)-四氫小檗堿的高效從頭合成