2024年8月15日，中國科院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心楊輝團隊與輝大（上海）生物科技有限公司研發(fā)團隊和復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院黃錦海團隊合作在Nature Chemical Biology上發(fā)表題為“Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing”?的研究論文。該研究通過宏基因組數(shù)據(jù)挖掘，鑒定出19種具有不同TAM范圍的新型IscB-ωRNA系統(tǒng)；綜合RNA結構優(yōu)化、蛋白質工程化改造、流式細胞術、脫靶檢測等技術手段，成功獲得在人類細胞內具有靶標識別范圍廣、更高效編輯活性的IscB系統(tǒng)（IscB.m16*）；通過融合脫氨酶結構域，進一步開發(fā)出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶堿基編輯器，并在哺乳動物細胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE無活性的疾病位點上均驗證了其強大的堿基編輯效率和廣泛的靶標識別能力，為未來精準基因治療臨床應用提供了強有力支持。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，得到快速發(fā)展已被廣泛應用生命科學基礎研究、基因治療、動植物育種改良等領域?；贑as9切口酶（nCas9）與脫氨酶結構域/糖基化酶（MPG或UNG）的融合成的堿基編輯器（ABE，CBE，gGBE，gTBE），可高效實現(xiàn)A-to-G，C-to-T，C-to-G，G-to-C/T，以及T-to-G/C的堿基替換，為糾正突變的疾病位點提供了精準高效基因編輯工具。然而由于Cas9的體積過大（1368個氨基酸），基于nCas9的堿基編輯器難以實現(xiàn)單個AAV（4.7kb)的包裝遞送，極大限制了在體基因編輯的發(fā)展應用。近年來一系列緊湊型的Cas9蛋白、Cas12f系列同源物、以及其祖先蛋白TnpB被報道，由于編輯活性有限，或缺乏HNH結構域而難以改造為缺口酶，都限制用于堿基編輯器的開發(fā)。

2021年，張鋒團隊發(fā)現(xiàn)由IS200/IS605轉座子超家族編碼的IscB核酸酶，被認為Cas9的祖先蛋白，具有與Cas9相似的HNH和RuvC結構域，且僅有約500個氨基酸（約SpCas9的1/3大?。?，具有開發(fā)成微型堿基編輯器的潛力。2023年，楊輝團隊通過對OgeuIscB/ωRNA系統(tǒng)的工程化改造，開發(fā)出了高效的OgeuIscB變體（enOgeuIscB），并通過融合脫氨酶結構域，開發(fā)出高效迷你型堿基編輯器（miBE），推動了DNA單堿基編輯領域進入迷你型的“新時代”，具有極大的臨床應用潛力（Nat Methods | "馴化"Cas9遠古祖先，楊輝團隊開發(fā)出基于IscB的極小型堿基編輯器）。然而，IscB/ωRNA系統(tǒng)需要嚴格的6位堿基靶序列鄰近基序（TAM）來識別目標DNA，識別位點有限。因此，開發(fā)靶標識別范圍更廣的高效小型IscB堿基編輯器是十分必要。

研究人員首先從200GB的宏基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘出19個未被表征的新型IscB系統(tǒng)，采用細菌耗竭實驗鑒定相應的TAM序列；進一步利用熒光報告系統(tǒng)，篩選出10個具有真核細胞活性的IscB系統(tǒng)，其中IscB.m16表現(xiàn)出最高的編輯活性。為提高IscB.m16系統(tǒng)的活性并拓寬TAM范圍，研究人員對IscB.m16核酸酶進行RuvC結構域的精氨酸掃描突變和TAM識別相關位點的飽和突變，以及對其ωRNA進行莖環(huán)截短和堿基替換的優(yōu)化改造。通過多輪迭代的高通量熒光報告系統(tǒng)篩選，最終獲得了編輯活性高和TAM范圍寬的IscB.m16變體(IscB.m16*,即IscB.m16^RESH-enωRNA)。通過細菌耗竭TAM序列識別實驗發(fā)現(xiàn)，相較于野生型IscB.m16的TAM位點MRNRAA擴展到NNNGNA。

在此基礎上，研究人員構建了迷你型腺嘌呤堿基編輯器（IscB.m16*-ABE）和胞嘧啶堿基編輯器（IscB.m16*-CBE）。在哺乳動物細胞中，IscB.m16*-ABE的堿基編輯效率與SpG-ABE效率相當，顯著高于已報道的enOgeuIscB-ABE且有更廣的TAM兼容性。在人源化杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）小鼠疾病模型中，單AAV包裝的IscB.m16*-CBE經注射至肌肉組織后，成功并高效的將小鼠肌纖維中dystrophin蛋白水平恢復至野生型小鼠的40%，為DMD患者提供了一種有希望的基因治療策略。

總的來說，該研究通過挖掘和優(yōu)化改造新型IscB系統(tǒng)，開發(fā)出靶向范圍更廣、活性更高、特異性更好的迷你型堿基編輯工具IscB.m16*-BE，在基于AAV的基因治療應用中顯示出獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。

中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心和輝大基因聯(lián)合博士后肖慶全，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心博士研究生韓鼎毅，輝大基因李國玲博士、王豪強，復旦大學附屬五官科醫(yī)院實習生姚鳴宇為該論文的共同第一作者。中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心楊輝研究員、輝大基因張海南博士、復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院黃錦海研究員以及輝大基因李彤博士為該論文的共同通訊作者。