2024年8月15日，中國科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝團(tuán)隊與輝大（上海）生物科技有限公司研發(fā)團(tuán)隊和復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院黃錦海團(tuán)隊合作在Nature Chemical Biology上發(fā)表題為“Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing”?的研究論文。該研究通過宏基因組數(shù)據(jù)挖掘，鑒定出19種具有不同TAM范圍的新型IscB-ωRNA系統(tǒng)；綜合RNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化、蛋白質(zhì)工程化改造、流式細(xì)胞術(shù)、脫靶檢測等技術(shù)手段，成功獲得在人類細(xì)胞內(nèi)具有靶標(biāo)識別范圍廣、更高效編輯活性的IscB系統(tǒng)（IscB.m16*）；通過融合脫氨酶結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步開發(fā)出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶堿基編輯器，并在哺乳動物細(xì)胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE無活性的疾病位點(diǎn)上均驗證了其強(qiáng)大的堿基編輯效率和廣泛的靶標(biāo)識別能力，為未來精準(zhǔn)基因治療臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力支持。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，得到快速發(fā)展已被廣泛應(yīng)用生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、基因治療、動植物育種改良等領(lǐng)域?；贑as9切口酶（nCas9）與脫氨酶結(jié)構(gòu)域/糖基化酶（MPG或UNG）的融合成的堿基編輯器（ABE，CBE，gGBE，gTBE），可高效實現(xiàn)A-to-G，C-to-T，C-to-G，G-to-C/T，以及T-to-G/C的堿基替換，為糾正突變的疾病位點(diǎn)提供了精準(zhǔn)高效基因編輯工具。然而由于Cas9的體積過大（1368個氨基酸），基于nCas9的堿基編輯器難以實現(xiàn)單個AAV（4.7kb)的包裝遞送，極大限制了在體基因編輯的發(fā)展應(yīng)用。近年來一系列緊湊型的Cas9蛋白、Cas12f系列同源物、以及其祖先蛋白TnpB被報道，由于編輯活性有限，或缺乏HNH結(jié)構(gòu)域而難以改造為缺口酶，都限制用于堿基編輯器的開發(fā)。

2021年，張鋒團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)由IS200/IS605轉(zhuǎn)座子超家族編碼的IscB核酸酶，被認(rèn)為Cas9的祖先蛋白，具有與Cas9相似的HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域，且僅有約500個氨基酸（約SpCas9的1/3大小），具有開發(fā)成微型堿基編輯器的潛力。2023年，楊輝團(tuán)隊通過對OgeuIscB/ωRNA系統(tǒng)的工程化改造，開發(fā)出了高效的OgeuIscB變體（enOgeuIscB），并通過融合脫氨酶結(jié)構(gòu)域，開發(fā)出高效迷你型堿基編輯器（miBE），推動了DNA單堿基編輯領(lǐng)域進(jìn)入迷你型的“新時代”，具有極大的臨床應(yīng)用潛力（Nat Methods | "馴化"Cas9遠(yuǎn)古祖先，楊輝團(tuán)隊開發(fā)出基于IscB的極小型堿基編輯器）。然而，IscB/ωRNA系統(tǒng)需要嚴(yán)格的6位堿基靶序列鄰近基序（TAM）來識別目標(biāo)DNA，識別位點(diǎn)有限。因此，開發(fā)靶標(biāo)識別范圍更廣的高效小型IscB堿基編輯器是十分必要。

研究人員首先從200GB的宏基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘出19個未被表征的新型IscB系統(tǒng)，采用細(xì)菌耗竭實驗鑒定相應(yīng)的TAM序列；進(jìn)一步利用熒光報告系統(tǒng)，篩選出10個具有真核細(xì)胞活性的IscB系統(tǒng)，其中IscB.m16表現(xiàn)出最高的編輯活性。為提高IscB.m16系統(tǒng)的活性并拓寬TAM范圍，研究人員對IscB.m16核酸酶進(jìn)行RuvC結(jié)構(gòu)域的精氨酸掃描突變和TAM識別相關(guān)位點(diǎn)的飽和突變，以及對其ωRNA進(jìn)行莖環(huán)截短和堿基替換的優(yōu)化改造。通過多輪迭代的高通量熒光報告系統(tǒng)篩選，最終獲得了編輯活性高和TAM范圍寬的IscB.m16變體(IscB.m16*,即IscB.m16^RESH-enωRNA)。通過細(xì)菌耗竭TAM序列識別實驗發(fā)現(xiàn)，相較于野生型IscB.m16的TAM位點(diǎn)MRNRAA擴(kuò)展到NNNGNA。

在此基礎(chǔ)上，研究人員構(gòu)建了迷你型腺嘌呤堿基編輯器（IscB.m16*-ABE）和胞嘧啶堿基編輯器（IscB.m16*-CBE）。在哺乳動物細(xì)胞中，IscB.m16*-ABE的堿基編輯效率與SpG-ABE效率相當(dāng)，顯著高于已報道的enOgeuIscB-ABE且有更廣的TAM兼容性。在人源化杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）小鼠疾病模型中，單AAV包裝的IscB.m16*-CBE經(jīng)注射至肌肉組織后，成功并高效的將小鼠肌纖維中dystrophin蛋白水平恢復(fù)至野生型小鼠的40%，為DMD患者提供了一種有希望的基因治療策略。

總的來說，該研究通過挖掘和優(yōu)化改造新型IscB系統(tǒng)，開發(fā)出靶向范圍更廣、活性更高、特異性更好的迷你型堿基編輯工具IscB.m16*-BE，在基于AAV的基因治療應(yīng)用中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的潛力。

中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心和輝大基因聯(lián)合博士后肖慶全，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心博士研究生韓鼎毅，輝大基因李國玲博士、王豪強(qiáng)，復(fù)旦大學(xué)附屬五官科醫(yī)院實習(xí)生姚鳴宇為該論文的共同第一作者。中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝研究員、輝大基因張海南博士、復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院黃錦海研究員以及輝大基因李彤博士為該論文的共同通訊作者。