小分子的三維結(jié)構(gòu)決定了配體與蛋白質(zhì)相互作用的選擇性，因此復(fù)雜手性分子的立體異構(gòu)體通常具有不同的生物活性，有時甚至表現(xiàn)完全相反的藥理作用。在過去的幾十年中，不對稱催化技術(shù)取得了顯著進展，可高選擇性地合成手性純的對映異構(gòu)體。相比而言，高選擇性合成目標產(chǎn)物的非對映異構(gòu)體更具挑戰(zhàn)。醛縮酶是一種催化C-C鍵形成的功能強大的酶，由于其催化的反應(yīng)通常具有極高的選擇性，且不同類型的醛縮酶能與各種親電試劑和親核試劑兼容，因此醛縮酶在手性藥物和精細化學(xué)品的合成中應(yīng)用廣泛。盡管如此，目前利用酶工程調(diào)控醛縮酶選擇性并應(yīng)用于非對映異構(gòu)體多樣性合成的研究鮮有報道。

針對上述問題，中國科學(xué)院上海藥物研究所（上海藥物所）廖蒼松課題組與中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所（天津工生所）盛翔課題組合作，利用聚焦理性迭代位點特異性突變（FRISM）策略對脫羧醛縮酶UstD進行了半理性工程改造，調(diào)控了UstD對鄰位二酮親電試劑的區(qū)域選擇性和立體選擇性，從而發(fā)散式地合成了30 種在α和γ位置具有立體中心的環(huán)狀亞胺酸分子，同時利用分子動力學(xué)模擬方法闡明了不同酶變體的選擇性調(diào)控機制。相關(guān)成果以“Semirational Protein Engineering of Decarboxylative Aldolase for the Regiodivergent and Stereodivergent Synthesis of Cyclic Imino Acids”為題于2025年1月15日在線發(fā)表于Angewandte Chemie International Edition。

UstD是一種PLP依賴性醛縮酶，負責抗腫瘤環(huán)肽化合物Ustiloxin B生物合成途徑的最后一步修飾反應(yīng)。UstD可以催化 L-天冬氨酸（L-Asp）與多種親電試劑之間的脫羧羥醛縮合反應(yīng)，以高效率和高選擇性生成具有γ仲醇或叔醇的非天然氨基酸。目前已報道的UstD 親電試劑包括了醛、酮、靛紅、茚二酮和酮酸酯等類型。基于UstD的多樣活性和高選擇性，研究人員設(shè)想是否可以通過改造UstD催化口袋的活性位點，調(diào)控UstD對鄰位二酮的立體選擇性簡潔合成鐵螯合劑Siderochelins等天然產(chǎn)物的環(huán)狀亞胺酸骨架，或者調(diào)控UstD的區(qū)域選擇性使烯胺中間體進攻位阻更大的酮羰基（圖1）。

研究人員在之前的研究工作中（Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202318550），通過實驗和計算相結(jié)合的方式闡明了UstD立體選擇性和區(qū)域選擇性的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)了Y257和K258對關(guān)鍵烯胺中間體的形成至關(guān)重要，而H148則與親電試劑形成氫鍵。在本研究中，為提高進化和篩選工作的效率，研究人員使用聚焦理性迭代位點特異性突變（FRISM）的半理性策略開展酶工程改造研究，通過酶變體設(shè)計探索底物結(jié)合口袋的殘基對選擇性的調(diào)控機制 (圖2)。經(jīng)過三輪突變后得到的UstD2.0_AAM（UstD2.0_{S60A/M299A/T388M}）對產(chǎn)物1c的轉(zhuǎn)化率為46%，選擇性為90%，對產(chǎn)物2b的轉(zhuǎn)化率為72%，選擇性為94%。研究人員通過2D ROESY實驗中 Cα-H 與甲基之間的關(guān)鍵相關(guān)性，解析了2b的立體構(gòu)型。后續(xù)研究人員利用ApUstD和UstD2.0_AAM高活性和高立體選擇性地合成了共計30種在α和γ位置具有立體中心的環(huán)狀亞胺酸，并實現(xiàn)了百毫克規(guī)模的制備反應(yīng)，收率高達89%。

為解析本研究中的立體選擇性和區(qū)域選擇性的調(diào)控機制，盛翔課題組利用分子動力學(xué)（MD）模擬研究了 ApUstD和UstD2.0AAM與底物的結(jié)合模式（以1為代表底物）。通過對酶活性口袋殘基與底物分子的相互作用分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ApUstD和UstD2.0_AAM兩種酶活性位點空腔大小和疏水性存在明顯差異，并提出這些差異導(dǎo)致了底物在口袋內(nèi)具有不同的結(jié)合構(gòu)象，也是不同酶表現(xiàn)出不同反應(yīng)選擇性的根本原因。

本研究中，上海藥物所和天津工生所合作通過理論計算和實驗研究結(jié)合的方式，利用FRISM策略，針對UstD活性位點的三個關(guān)鍵殘基創(chuàng)建了一個小型突變體庫，成功調(diào)控了UstD的區(qū)域選擇性和非對映選擇性。獲得的工程酶變體具有極佳的選擇性和較廣的底物譜，拓展了環(huán)亞胺酸的結(jié)構(gòu)多樣性。此外，廖蒼松課題組最近還報道了不同的醛縮酶可接受多樣性的二酮化合物作為親電試劑，用于合成多樣的含叔醇手性小分子（ChemCatChem 2024, 16, e202400337）。利用FRISM策略改造醛縮酶有望實現(xiàn)其它醛縮酶選擇性的精準調(diào)控并應(yīng)用于高價值手性小分子的高效不對稱合成。

上海藥物所廖蒼松研究員、天津工生所盛翔研究員以及上海藥物所張睿副研究員為論文共同通訊作者。上海藥物所碩士研究生蘭羽秋和川北醫(yī)學(xué)院的張成華副教授為論文共同第一作者。本課題的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析工作得到了上海藥物所葉陽研究員和唐春萍高級工程師的合作支持。該研究工作得到國家重點研發(fā)計劃，國家自然科學(xué)基金，廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃等項目的資助。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202500080

圖1：UstD的多樣親電試劑和選擇性

圖2：理論計算指導(dǎo)下的UstD工程改造

圖3：半理性改造UstD實現(xiàn)環(huán)亞胺酸發(fā)散合成

（供稿部門：廖蒼松課題組 ；供稿人：蘭羽秋 ）