2025年6月25日，中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合張余研究團(tuán)隊(duì)以及上海師范大學(xué)王文琴研究團(tuán)隊(duì)在Nature Plants上發(fā)表了題為 “PEN1 catalyses RNA primer removal during plastid DNA replication in maize”的研究論文?？蒲腥藛T經(jīng)過(guò)八年不懈探索，最終揭示了植物質(zhì)體DNA（ptDNA）復(fù)制體中RNA引物切除的核心核酸酶組分plastid-localized and Mn²⁺-dependent 5’-3’exonuclease 1 (PEN1)。長(zhǎng)期以來(lái)，植物ptDNA復(fù)制中負(fù)責(zé)RNA引物切除的核酸酶一直未被鑒定到，而PEN1的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了這一關(guān)鍵領(lǐng)域的空缺，完善了ptDNA復(fù)制理論。

DNA復(fù)制是生命科學(xué)的核心基礎(chǔ)問題之一。雙鏈DNA解旋后引物酶在模板鏈上合成RNA引物。前導(dǎo)鏈僅需合成一個(gè)RNA引物即可由高持續(xù)合成能力的DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)連續(xù)延伸，而滯后鏈則需合成多個(gè)RNA引物，通過(guò)不連續(xù)的岡崎片段合成方式完成復(fù)制。DNA復(fù)制后，RNA引物由核酸酶負(fù)責(zé)切除，從而保證基因組的完整性。在原核生物中，如大腸桿菌，DNA聚合酶III是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的聚合酶，而DNA聚合酶I是負(fù)責(zé)切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I除了具有聚合酶活性外，還具5′-3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA鏈時(shí)，同步利用其外切酶活性切除RNA引物，這一過(guò)程稱為缺口翻譯（Nick translation）。

在內(nèi)共生過(guò)程中，光合藍(lán)細(xì)菌被非光合真核生物整合共生，最終演變成了質(zhì)體。質(zhì)體根據(jù)其形態(tài)和功能的差異，主要分為葉綠體、淀粉體和有色體等，它們分別在光合作用、淀粉合成和代謝調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。盡管功能各異，但所有質(zhì)體都起源于共同的前體（前質(zhì)體），并具有相同的遺傳物質(zhì)。質(zhì)體是半自主的細(xì)胞器，Pol1A和1B負(fù)責(zé)ptDNA的復(fù)制；然而，其缺乏DNA聚合酶I類似的5’-3’外切酶結(jié)構(gòu)域。因此，負(fù)責(zé)ptDNA復(fù)制過(guò)程RNA引物切除的核酸酶的身份，長(zhǎng)期以來(lái)一直是一個(gè)未解之謎。擬南芥中，AtRNH1C可能參與RNA引物切除；然而，這一過(guò)程并非完全高效，AtRNH1C切割后會(huì)在RNA-DNA連接處殘留1-3個(gè)核糖核苷酸，從而抑制DNA片段的連接。因此，研究人員推測(cè)還需要其他尚未被鑒定的質(zhì)體定位的核酸酶來(lái)完全切除RNA引物并允許DNA片段連接，從而確保ptDNA復(fù)制的成功完成。

2017年，剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的研究生黃興和導(dǎo)師巫永睿研究員在山東泰安的夏季試驗(yàn)田里，從甲基磺酸乙酯（EMS）誘變?nèi)后w分離到pen1突變體。與之前報(bào)道的在世代間表現(xiàn)出穩(wěn)定遺傳表型的籽粒突變體不同，pen1胚乳發(fā)育和灌漿存在缺陷，且隨著世代繁衍加劇的特征。值得注意的是，pen1/+自交分離的純合突變體（pen1^F2）的胚乳質(zhì)體發(fā)育僅伴隨輕微缺陷，而pen1^F2繼續(xù)自交后代（pen1^F3）的胚乳前質(zhì)體均不能正常分化，胚乳表現(xiàn)為完全空殼。

研究人員成功分離了Pen1位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其編碼質(zhì)體特異定位的5’-3’外切酶。PEN1與ptDNA復(fù)制體的其他成分（Pol1A/1B和連接酶LIG1）共定位于葉綠體擬核。研究表明，PEN1能高效切割RNA引物切除過(guò)程中間體，并完全移除RNA-DNA連接處的核糖核苷酸，從而促進(jìn)了LIG1的連接。研究人員成功在體外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1介導(dǎo)的質(zhì)體RNA引物去除過(guò)程，證實(shí)PEN1的確參與了ptDNA復(fù)制過(guò)程RNA引物移除。

此外，研究人員還解析了PEN1-雙鏈DNA二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在PEN1的催化中心，被切割DNA鏈的第1個(gè)核苷酸的5’單磷酸基團(tuán)與活性中心的Mg2+形成配位鍵、連接第2和第3個(gè)核苷酸的磷酸二酯鍵同時(shí)與K250、R264、R283形成三個(gè)鹽橋，這使得被切割DNA鏈在活性中心的相對(duì)位置被固定，從而使PEN1精確切割1和第2個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，發(fā)揮其核酸外切酶活性。為了探究Pen1突變對(duì)ptDNA的影響，研究人員通過(guò)分離ptDNA和Detail-Seq發(fā)現(xiàn)Pen1功能缺失直接導(dǎo)致ptDNA的斷裂，且斷點(diǎn)主要積累在ptDNA正義鏈上。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)Pen1功能缺失抑制了ptDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性，從而影響了質(zhì)體的正常發(fā)育和功能。

對(duì)質(zhì)體遺傳和復(fù)制機(jī)制的系統(tǒng)性闡述，對(duì)于理解質(zhì)體發(fā)育和推動(dòng)植物遺傳工程至關(guān)重要。盡管已鑒定出越來(lái)越多參與ptDNA復(fù)制的因子，但負(fù)責(zé)移除RNA引物的特定組分一直不明確。本研究鑒定到的質(zhì)體特異性的5’-3’外切酶PEN1能直接催化質(zhì)體DNA復(fù)制過(guò)程中RNA引物的移除，并闡明了其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)為質(zhì)體復(fù)制（尤其是RNA引物移除過(guò)程）提供了深刻的見解，助于推動(dòng)作物改良的質(zhì)體遺傳工程進(jìn)展。

中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士后黃興，博士生石國(guó)龍以及已畢業(yè)博士肖俏（現(xiàn)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后）為本研究論文的共同第一作者。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)黃永財(cái)教授，上海師范大學(xué)研究生馮嬌嬌等參與了該研究。中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿和張余研究員以及上海師范大學(xué)王文琴教授為通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)研究中心孫前文副教授和張衛(wèi)峰博士在ptDNA損傷檢測(cè)提供了大量幫助。該研究工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)和青A延續(xù)，中國(guó)科學(xué)院先導(dǎo)B，尚思探索學(xué)者和國(guó)家資助博士后B類等項(xiàng)目的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-025-02027-4

PEN1介導(dǎo)ptDNA復(fù)制RNA引物的移除

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