2025年6月27日，中國科學(xué)院上海藥物研究所陸曉杰課題組聯(lián)合趙玉軍課題組和中國藥科大學(xué)褚錢課題組，在DNA編碼環(huán)肽庫篩選與分析領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。研究成果系統(tǒng)揭示了包含多種成環(huán)方法的環(huán)肽庫不一樣的篩選結(jié)果，并提出了不同的化合物挑選和驗(yàn)證方法。相關(guān)成果以“Influence of Macrocyclization Strategies on DNA-Encoded Cyclic Peptide Libraries”為題發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊JACS Au。

環(huán)肽因其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，近年來在口服藥物、多肽偶聯(lián)藥物、診斷試劑等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。然而，如何高效篩選并發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)異性質(zhì)的新型環(huán)肽分子一直是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。DNA編碼化合物庫技術(shù)（DNA-Encoded Library Technology,DELT）的快速發(fā)展，為環(huán)肽分子的高通量篩選提供了高效、便捷且經(jīng)濟(jì)的平臺。DELT通過將特定的核酸標(biāo)簽與多肽分子連接，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)?；衔飵斓目焖贅?gòu)建和篩選，在引入各類非天然氨基酸和成環(huán)方法上具有先天的優(yōu)勢。

以往的研究多采用單一環(huán)化策略構(gòu)建化合物庫，對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。然而，這種單一策略往往存在假陽性風(fēng)險，且可能遺漏部分高活性分子，限制了篩選結(jié)果的全面性和準(zhǔn)確性。因此，研究團(tuán)隊(duì)充分利用DELT的合成靈活性，設(shè)計并快速合成了八個環(huán)肽子庫。每個子庫均采用相同的合成砌塊組合，但最終通過不同的環(huán)化方法完成環(huán)肽骨架的構(gòu)建。八個子庫共同組成了一個包含約1億種不同環(huán)肽分子的超大規(guī)模環(huán)肽庫。團(tuán)隊(duì)以腫瘤相關(guān)蛋白MDM2和蛋白-蛋白相互作用調(diào)控因子GIT1為代表靶點(diǎn)，開展了系統(tǒng)的篩選與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

在MDM2的篩選中，研究發(fā)現(xiàn)多個子庫展現(xiàn)出高度一致的富集模式，特定氨基酸序列的環(huán)肽在不同環(huán)化策略下均被富集。進(jìn)一步的off-DNA合成及體外活性檢測顯示，這些序列相同但環(huán)化方式不同的環(huán)肽均表現(xiàn)出優(yōu)異的靶點(diǎn)結(jié)合能力，其中最高結(jié)合活性（K_i）達(dá)11 nM。這一結(jié)果表明，跨子庫的結(jié)構(gòu)富集模式可以顯著提升篩選苗頭分子的可靠性。與此同時，團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，部分在單一子庫中富集度較低的環(huán)肽組合，經(jīng)off-DNA合成后同樣展現(xiàn)出良好活性。這一現(xiàn)象提示，單一子庫篩選可能低估了部分高活性分子的潛力，強(qiáng)調(diào)了多子庫交叉分析的重要性。

針對GIT1的篩選則呈現(xiàn)出另一種典型情形：不同子庫間未觀察到一致的富集模式。團(tuán)隊(duì)通過標(biāo)準(zhǔn)化流程篩選出的兩個環(huán)肽化合物，進(jìn)一步體內(nèi)外驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其中一個環(huán)肽能夠特異性結(jié)合GIT1并有效阻斷其與β-PIX的相互作用（K_i=1.22 μM），而另一個分子則未顯示出阻斷活性。通過熱轉(zhuǎn)移、等溫滴定量熱等多種生物物理方法結(jié)合突變體分析，研究團(tuán)隊(duì)明確了關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。這一結(jié)果表明，面對單一富集結(jié)果，可以結(jié)合競爭性篩選、體外實(shí)驗(yàn)等多種手段，綜合驗(yàn)證篩選命中分子的真實(shí)性和特異性。

本研究展示了由多種成環(huán)方法構(gòu)建的環(huán)肽庫的兩種篩選結(jié)果，強(qiáng)調(diào)了系統(tǒng)研究多組富集數(shù)據(jù)在挑選化合物中的關(guān)鍵作用。而對缺乏一致性的數(shù)據(jù)中，建議結(jié)合額外的競爭篩選和體外驗(yàn)證以多維度驗(yàn)證苗頭化合物。

上海藥物所研究生趙翰卿、中國藥科大學(xué)研究生李雪為本論文的共同第一作者。上海藥物所陸曉杰研究員、中國藥科大學(xué)褚錢教授、上海藥物所趙玉軍研究員和蘇州阿爾脈生物科技有限公司王璇博士為本論文的共同通訊作者。本研究得到了國家自然科學(xué)基金委和原創(chuàng)新藥研究全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。

原文連接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.5c00473

DNA編碼環(huán)肽庫的構(gòu)建及其親和篩選流程